鳞状细胞癌发生率约占头颈部恶性肿瘤的90%，而口腔鳞状细胞癌是全球头颈部鳞状细胞癌的主要类型，但这些恶性肿瘤的分子机制尚不清楚。因此，识别与口腔和食管鳞状细胞癌发病机制相关的未知危险因素，将为预防和治疗这些恶性肿瘤提供有效的治疗策略。中国医学科学院/北京协和医学院刘芝华教授团队在Cell Reports（IF 9.995）发表了题为“OTUB2 exerts tumor-suppressive roles via STAT1-mediated CALML3 activation and increased phosphatidylserine synthesis”的研究论文，该研究通过转录组学、蛋白组学、脂质组学以及分子生物学实验验证，揭示了OTUB2/STAT1/CALML3/PS轴具有抑癌作用，并显示了PS（phosphatidylserine，磷脂酰丝氨酸）给药作为治疗和预防上消化道鳞状细胞癌的策略的潜力。其中，中科新生命提供了转录组、蛋白组、代谢组的检测和技术支持服务。
研究材料
鳞状细胞癌小鼠模型、OTUB2敲除鳞状细胞癌小鼠模型、人鳞状细胞癌细胞系
技术路线
步骤1：OTUB2在正常食管上皮及食管鳞状细胞癌组织中的表达检测
步骤2：多组学联合分析揭示CALML3是介导OTUB2抑癌功能的关键下游基因
步骤3：OTUB2/CALML3轴激活Ca2+信号通路，促进PS的合成
步骤4：OTUB2是通过介导STAT1的泛素化修饰影响磷酸化，激活CALML3转录
步骤5：临床前研究提示口服磷脂酰丝氨酸抑制上消化道鳞状细胞癌的发生
步骤2：多组学联合分析揭示CALML3是介导OTUB2抑癌功能的关键下游基因
步骤3：OTUB2/CALML3轴激活Ca2+信号通路，促进PS的合成
步骤4：OTUB2是通过介导STAT1的泛素化修饰影响磷酸化，激活CALML3转录
步骤5：临床前研究提示口服磷脂酰丝氨酸抑制上消化道鳞状细胞癌的发生
研究结果
- OTUB2抑制上消化道鳞状细胞癌的发生
为了研究OTUB2在上消化道鳞状细胞癌中的功能，作者首先检测了其在正常食管上皮及食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中的表达情况，相较于ESCC组织，OTUB2在正常食管上皮中高表达，且预后分析表明OTUB2高表达的食管鳞状细胞癌患者预后更好。于是，作者构建了一个OTUB2敲除ESCC小鼠模型，OTUB2敲除ESCC小鼠中发生舌瘤结节数量及ESCC发生率明显高于野生型ESCC小鼠。接下来，作者将OTUB2敲除的上皮细胞系异种移植到小鼠体内，观察OTUB2敲除是否可以促进人鳞状细胞癌的发生，结果发现，OTUB2沉默的上皮细胞表现出较强的致癌能力，进一步验证了OTUB2在上消化道鳞状细胞癌发生中的抑癌作用。
图1 OTUB2肿瘤抑制作用
2. 多组学联合分析揭示CALML3是介导OTUB2抑癌功能的关键下游基因
作者通过转录组和蛋白质组学联合分析，探讨OTUB2肿瘤抑制机制。联合分析显示11个基因的mRNA水平和蛋白水平表现出一致的上调或下调，其中，CALML3被选择进行进一步研究，因为据报道它在口腔和皮肤鳞状细胞癌中下调，并作为区分肺鳞状细胞癌和肺腺癌的重要标志物。在SCC细胞中过表达OTUB2后肿瘤的生长受到抑制，且过表达OTUB2后CALML3 mRNA和蛋白水平持续升高，而CALML3敲低消除了OTUB2对肿瘤发生的抑制。这些结果证实了CALML3是介导OTUB2肿瘤抑制功能的关键下游效应因子。
3. OTUB2/CALML3轴通过控制细胞内Ca2+水平来调节PS的合成
为了确定OTUB2/CALML3抑制肿瘤作用的下游事件，对转录组和蛋白质组数据进行了KEGG富集分析，发现几种脂质代谢途径显著富集。于是作者对小鼠肿瘤组织进行脂质组学分析，在OTUB2和CALML3表达组中甘油磷脂显著增加，其中磷脂酰丝氨酸（PS）最为显著，提示这可能是介导OTUB2抑癌功能的关键代谢事件。
钙调素是一种多功能的Ca2+感应蛋白，通过调节靶蛋白来控制各种细胞事件。CALML3与钙调素有85%的同源性，作者预测CALML3与钙调素一样，可通过感应Ca2+水平调节离子通道。研究发现，过表达OTUB2或CALML3显著增加了细胞内Ca2+的浓度，用Ca2+通道抑制剂处理细胞后，完全消除了OTUB2或CALML3过表达引发的PS合成升高，证明OTUB2/CALML3轴通过控制细胞内Ca2+水平来调节PS的合成。
图3 OTUB2/CALML3增加了细胞内Ca2+水平和甘油磷脂的合成
4.STAT1是介导OTUB2对CALML3转录激活的关键转录因子
OTUB2通过激活CALML3来抑制SCC，然而，OTUB2本身的蛋白结构没有作为转录因子的特点，因此作者进一步通过质谱鉴定，锁定了STAT1是介导OTUB2对CALML3转录激活的关键转录因子。
泛素化实验证实STAT1是去泛素化酶OTUB2的直接底物，且OTUB2对STAT1的去泛素化修饰在不影响其蛋白稳定性的情况下促进了STAT1的Tyr701位点磷酸化修饰及进一步的二聚体形成。这些结果揭示了去泛素化修饰、磷酸化对转录因子STAT1活性的调控，随后增强CALML3的转录激活。
图4 OTUB2介导STAT1的泛素化修饰影响磷酸化
5. 口服PS可抑制肿瘤的干细胞性来阻止鳞状细胞癌的发生
PS是细胞膜的功能成分，是神经系统的重要组成部分。PS在肉、脑组织、大豆和其他内脏器官中含量丰富。外源性PS可以跨越血脑屏障，并已被证明可以改善记忆力、注意力和学习能力。PS已被批准为世界范围内的食品补充剂，健康补充剂。然而，补充PS是否发挥抗癌作用仍不清楚。为了进一步验证口服PS对上消化道鳞状细胞癌的抑制功能，作者利用鳞状细胞癌人源肿瘤组织异种移植模型进行了临床前研究，并发现口服PS显著抑制了OTUB2低表达鳞状细胞癌的发生以及增强了其对化疗药物的敏感性。这些数据证明了口服PS的靶向作用，为后续进一步探索应用PS预防及治疗人类恶性肿瘤提供了重要的前期基础。
图5 口服磷脂酰丝氨酸抑制上消化道鳞状细胞癌的发生
结论
本文章利用多组学整合分析系统的研究了OTUB2在上消化道鳞状细胞癌中的重要抑癌功能，并发现该功能是通过促进转录因子STAT1的磷酸化及二聚体形成进而激活CALML3转录而实现的。其中磷脂酰丝氨酸合成增加是介导OTUB2抑癌功能的关键代谢事件，并且临床前研究结果提示口服磷脂酰丝氨酸可能会为抑制上消化道鳞状细胞癌的发生带来帮助。
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