【蛋白研究系列专题】-19丨PCR技术的前世今生(下)-自主发布-资讯-生物在线

【蛋白研究系列专题】-19丨PCR技术的前世今生(下)

作者:武汉金开瑞生物工程有限公司 2017-05-22T17:31 (访问量:2515)

接着上期,我们继续回到故事里面。
 
关于Mullis发现PCR的过程,比较公认的版本是,有一天他驾车开过蜿蜒山路的时候,开始琢磨他的检测单碱基突变的方法。这一次他想到的点子是,既然结合一条引物是可行的,为什么不试试看同时结合两条引物呢。于是Mullis开始在脑海里模拟这个实验:设计两条引物,分别结合在DNA的正义链和反义链上,且这两条引物的3’端均位于待测碱基的上游1个碱基的位置。这样,当进行Oligomer Restriction检验的时候,两条链上都会延伸结合上相应的ddNTP。只需要在原先设计引物的时候将两个引物的长度设计得不一样,得到的两个产物就能够在DNA胶上被区分开来。这样,一次检测就能同时得到两个结果,这两个结果可以互为对照组,如果两条链的结果得到的碱基可以互相配对成功,那么证明实验体系没有问题,结果可信;反之,如果两条链结果不一致,那么很有可能是实验过程中出现了问题。
 
Mullis开始模拟实验:如果混入了dNTP,那么聚合酶在延伸DNA链时则会有时用dNTP有时用ddNTP,使得ddNTP结合的位置就变得不确定,通过他的对照组的设计就能够检测出来,该组实验结果不能采信。很好,对照组的效果不错。那么,有没有什么办法可以避免dNTP的混入呢?比如用碱性磷酸酶(BAP,Bacteria Alkaline Phosphate)呢?用BAP除去原有混合物里面的磷酸基团,随后再加入ddNTP开始反应,这样应该不错。不过得想个办法在加入ddNTP之前除去BAP的活性。

由于一时想不到好的解决办法,于是Mullis便开始想,那么就先这样吧,让那些混入的dNTP先留在反应体系里面,看看会发生什么事。于是,在那条漫长的公路上,他又开始继续他的思维模拟实验。这一次,他碰到了真理——PCR。当Mullis继续想着他的模拟实验的时候,他距离真理已经越来越近了。如果原先的反应体系里面混有dNTP,那么不妨先加入DNA聚合酶让反应发生,这时dNTP就会被作为原料完成DNA复制的反应;而此时只需要加热使DNA双链变性,再冷却复性时由于引物的量很多,因此原来的DNA链与引物结合的可能性最大,这样就达到了去除dNTP的目的。但是,如果dNTP的量比较多,延伸得比较长,使得变性复性之后,新合成的链与下游的反向引物结合了呢?
 
EUREKA(找到了)!这样也没有关系,不就是模板链加倍了吗!单碱基突变检测照常进行!那么我可以有意多加引物保证模板链复制以提高效率!如果像这样一遍一遍重复,那么模板DNA就可以不断复制扩增了!单碱基检测的效率就大大提高了!
 
于是Mullis开始给Cetus其他的科学家们讲他的想法,但是除了他的女友Jennifer以及为数不多的几个技术员之外,其余的人都对他的想法并不感兴趣。不过同时,他的同事们也并不能从他的设计里面挑出任何漏洞。也就意味着,很有可能方案可行。

接下来就是实验验证了,在实验中他也经历了一些挫折。终于在1984MullisCetus公司对于PCR技术申请了技术**,并且撰写了文章发表。由公司撰写的关于PCR技术应用的文章很快在Science上刊发,但是由于种种原因,Mullis撰写的PCR原理的文章先后被natureScience拒绝,最后只能发表在不知名的Methods of Enzymology (《酶学方法》)杂志上(真是天大的遗憾啊,估计此时natureScience肠子都悔青了!)。
写到最后,回顾PCR发明的科学历程,还是非常有趣的。通常我们研究一个科学问题的思路,是提出一个重大的科学问题(Question),找到一个适合的研究体系(System),并借助于相关的技术(Technique)进行实验探索与猜想验证。如果不是这个思维极度发散,同时又善于抓住重要问题的“科学怪才”,即便是好点子送上们来也只怕会擦肩而过了。
 
 
 
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