膳食纤维作为近几年来备受学术界和营养界关注的营养素，一般都被认为是有益的。因其具有防止便秘、预防肥胖，改善血糖症状等功效，目前被普遍接受并作为食品添加剂或者营养增补剂食用。代谢组学分享，这篇文章以小鼠模型为研究对象，进行膳食纤维功能性研究，发现喂食膳食纤维后，会诱发小鼠黄疸型肝癌，那具体是怎么研究、怎么得出这样的结论以及结论是否可信呢？待百趣代谢组学的小趣细细道来。

1.代谢组学文献分享—研究背景

膳食纤维是一种多糖，被营养学界认定为第七类营养素，可大致分类为不溶性或可溶性两种，前者不容易被消化吸收，主要用于促进胃肠道蠕动，后者易于被肠道细菌代谢，产生有价值的营养素如短链脂肪酸提供给宿主。代谢组学分享，文章主要采用的研究材料为来源于菊苣的菊粉（inulin），一种水溶性膳食纤维，而该研究的最初目的是测试可发酵纤维菊粉和由其代谢产生的营养素是否可改善T5KO小鼠（一种免疫缺陷型小鼠，没有TLR5基因，会出现肠道菌群紊乱和代谢性疾病）的代谢综合征。

2.代谢组学文献分享—研究方法

（1）实验分组

主要分组如下：

按照小鼠类型分组：野生型小鼠（WT） 、基因缺陷型小鼠（ T5KO 、 Lcn2KO 、 Myd88KO、T4KO 、 Nlrc4KO ）、无菌C57BL/6 WT 和 T5KO 小鼠。

按照血清胆红素水平分组：正常血清胆红素（NB，1-4.5mmol / L）组、高血清胆红素（HB，6-8mmol / L）组。

按照饮食配方分组：含有菊粉的饮食（ICD， 7.5％菊粉和2.5％纤维素）、含有较低剂量菊粉饮食（ICD-L，2.5％菊粉和7.5％纤维素）、含纤维素饮食（CCD）、含果胶饮食（PCD）、含低聚果糖的饮食（FCD），高脂肪含有菊粉（HFD-I）或纤维素（HFD-C）的饮食。

按照处理方式分为：甲硝唑处理组、β-酸处理组、抗生素处理组。

按培养方式分为：独立培养、共同培养、交叉培养。

（2）检测平台

代谢组学：GC-MS(肝脏脂质、盲肠内容物)、LC-MS(血清、肝脏、粪便胆汁酸)、NMR(肝脏和盲肠内容物)

转录组学：Illumina HiSeq 4000（肝脏）

蛋白组学：LC-MS2/MS3(肝脏)

16S rRNA测序：Illumina（粪便）

生化试剂盒（血糖、血脂、酶定量、总胆汁酸等）

ELISA、qPCR、Immunoblotting

免疫组织化学染色、组织化学染色等

（3）数据分析

GraphPad Prism 7.0 program：D’Agostino-Pearson omnibus normality test；Nonparametric tests；Dunnett’s post hoc test；Tukey’s multiple comparison tests；unpaired, two-tailed t test ；one-way ANOVA ；Spearman correlation.

3.代谢组学文献分享—研究结果

（1）菊粉可改善代谢综合征但导致T5KO小鼠肝功能障碍

喂食T5KO小鼠含菊粉的饮食（ICD）可以降低~40％的肥胖发生率，伴随着代谢综合征指数的降低，同时发现这些小鼠血清中出现亮黄色，这是由胆红素升高所引起的现象，标志着胆汁淤积。代谢组学分享，进一步将小鼠分为高（HB）或正常（NB）胆红素组，高胆红素（H-bili）主要是结合胆红素增加。与WT和NB小鼠相比，HB小鼠中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT，肝功能损害最敏感的检测指标）显著增加，肝脏解毒功能指标血清马尿酸盐和对氧磷酶1（PON1）活性降低，血清白蛋白降低进一步表明肝功能受损（图1）。

图1 菊粉可改善代谢综合征但导致T5KO小鼠肝功能障碍图（图中红色圆圈里的点代表~40％ICD喂养的T5KO小鼠）

（2）长期喂食菊粉诱导T5KO小鼠黄疸型肝细胞癌（HCC）

ICD喂养小鼠6个月后，40％的T5KO小鼠产生多结节HCC，血清甲胎蛋白（AFP，原发性肝癌的血清标志物）升高，而野生型小鼠则不产生HCC。进一步发现肿瘤呈现原发性和肝特异性，主要表现为小梁样、有丝分裂相、不等红细胞增多、细胞肿胀，凋亡体以及异位淋巴聚集物，形成非典型胆管。事实证明，HCC发病率与高胆红素强烈相关（即HB中为100％，NB小鼠中为0％）。（图2）

图2 长期喂食菊粉诱导T5KO小鼠黄疸型肝细胞癌（HCC）（肝脏图片中黄色箭头表示多结节HCC；PCNA图中红色箭头指向PCNA阳性细胞，提示有肿瘤的可能）

（3）长期喂食菊粉对其他品系小鼠影响

菊粉诱导黄疸型肝癌是否只对T5KO小鼠具有特异性？为论证这一猜测，进一步研究了其他先天免疫缺陷型小鼠，是否在ICD喂养后发生HCC。代谢组学分享，结果显示Tlr4KO 和Lcn2KO小鼠在食用含菊粉饮食后同样发生高胆红素和HCC，发生率相对较低，并且缺乏MyD88的小鼠不产生HCC。这些现象表明，ICD对HCC的诱导并不绝对是在TLR5缺失的情况下，也可能是以MyD88依赖的方式，同时也表明肠道菌群失调跟肝癌有一定的关系（图3）。

图3 长期喂食菊粉对其他品系小鼠诱导HCC的影响（红色圆圈里的点代表高胆红素和HCC小鼠）

（4）不同饮食成分对T5KO小鼠诱导HCC的影响

为了阐明其他类型的膳食纤维是否同样可以诱导小鼠产生HCC，进而研究了可溶性膳食纤维果胶（多聚半乳糖醛酸）、低聚果糖和不可溶性膳食纤维纤维素代替菊粉来喂养小鼠。代谢组学分享，结果显示含果胶和低聚果糖的饮食喂养的T5KO小鼠中各有两只为H-bili和HCC阳性（发病率分别为~13％，~12.5％），而喂食含纤维素饮食的小鼠未发生HCC，同时发现喂食低剂量的菊粉饮食仍足以诱导HCC（即22只小鼠中有4只H-bili和HCC阳性）。结果表明HCC可以由可溶性纤维果胶和低聚果糖及低剂量的ICD诱导，但不能由不可溶纤维素诱导（图4）。

高脂肪饮食（HFD）也会导致肠道菌群失调和代谢综合征，从而考虑喂食富含菊粉和纤维素的HFD对小鼠的影响，特别是WT小鼠是否可能发生HCC。代谢组学分享，结果显示富含菊粉的高脂饮食可诱导WT小鼠黄疸型HCC，加重T5KO小鼠的病情严重程度（病发率从~40％增加至~65％），而富含纤维素的高脂饮食则无明显变化，表明代谢紊乱在肝癌的进展过程中起作用（图5）。

图4 不同膳食纤维对小鼠诱导HCC的影响（红色圆圈里的点代表产生肝癌的小鼠）

图5 高脂饮食对小鼠诱导HCC的影响（圆圈里的点代表产生肝癌的小鼠）

（5）肠道菌群变化

可溶性纤维在体内会被肠道菌群降解，继而从肠道菌群着手研究致癌的关键因素。与WT小鼠相比，T5KO相关的肠道菌群失调的特征在于总粪便细菌负荷增加（即NB中≥2倍，HB中≥3.5倍）。代谢组学分享，HB小鼠表现为无壁菌门减少，变形菌门和梭菌属（包含一群纤维发酵细菌）增加，并且明显减少了物种丰富度和α多样性。在ICD和CCD喂养的T5KO小鼠之间也观察到由于饮食导致的微生物群落构成的改变（图6）。

图6 肠道微生物组成变化

为了研究肠道微生物群在ICD诱导产生HCC过程中的作用，研究者同时饲养T5KO小鼠与WT小鼠，从而允许通过粪便转移微生物群，结果发现WT小鼠也罹患了HCC。交叉饲养的WT小鼠中出现HCC的现象进一步肯定了微生物群在ICD诱导的HCC中的关键性作用。

代谢组学分享，在使用广谱抗生素处理后，减轻了ICD喂养的T5KO小鼠中的HCC，12只抗生素处理的T5KO小鼠中只有1只表现出血清胆红素、AFP、ALT略有增加，但没有明显的肿瘤。此外，喂食ICD的无菌T5KO小鼠没有重现H-bili或HCC。结果表明在长期用ICD喂养时，需要使用生态失调微生物群来发展HCC，并且致癌微生物群可传染给易感宿主（图7）。

图7 菊粉诱导的HCC依赖于微生物

菊粉的发酵促进了HCC，那么抑制发酵可能会降低HCC的发病率。研究者使用甲硝唑（可以消耗产生丁酸盐的细菌）和来自啤酒花（Humulus lupulus）的β-酸（抑制细菌发酵）处理后，发现可以有效降低T5KO小鼠中HCC的发生率，其中，β-酸以剂量依赖性方式降低HCC的发生率。

代谢组学分享，由于纤维素不能被肠道细菌发酵，因而以不可溶的纤维素取代菊粉，也可用来阻止肝癌的发展。结果表明长期暴露于可溶性纤维微生物发酵的环境中，可促进ICD喂养的T5KO小鼠肝细胞癌的发生，抑制微生物发酵可以保护小鼠免受ICD诱导的HCC的侵袭（图8）。

图8 抑制细菌发酵和干预饮食可预防菊粉诱导的T5KO小鼠肝癌

（6）ICD诱导T5KO小鼠HCC起因机制研究

为了研究肝癌发生的起因，在给予小鼠ICD 4周后进行详细分析。结果发现HB小鼠的血清中，初级和次级胆汁酸均升高。相反，HB小鼠中粪便胆汁酸的水平显著降低或不可检测。HB和NB之间的肝胆汁酸的差异不太显著，但是仍显示在HB小鼠中有适度升高的趋势（图9）。

代谢组学分享，细胞凋亡反应伴随着化学诱导物（即KC和sICAM-1）和中性粒细胞浸润肝脏水平的增加， MPO 、NE 、ROS水平升高可能导致肝损伤，HB肝脏显示出更多的氧化应激和DNA损伤（图10）。结果表明在ICD喂养的T5KO小鼠中，HCC是由胆汁淤积、肝细胞死亡和中性粒细胞炎症引起的。

图9 胆汁酸代谢

图10 短期ICD喂养可诱导T5KO小鼠肝脏高胆红素、细胞凋亡和中性粒细胞浸润

4.代谢组学文献分享—小结

（1）长期喂食富含可溶性膳食纤维饮食，可使肠道菌群失调的T5KO等免疫缺陷小鼠发生胆汁淤积、肝脏炎症和黄疸型肝癌（HCC），而不可溶纤维无此作用；

（2）可溶性纤维诱导的HCC是依赖于微生物群，并且可传递给WT小鼠；

（3）长期喂食富含菊粉的高脂饮食，可使野生型小鼠发生HCC，增加T5KO小鼠HCC发病率；

（4）抑制肠道微生物发酵或从饮食中排除可溶性纤维是减轻ICD诱导HCC的可行策略。

5.代谢组学文献分享—讨论

那么膳食纤维以后到底还能不能吃？针对本文的研究结果，小趣以为正常适量食用没有太大问题，因为：实验中使用的是免疫缺陷型的小鼠，肠道细菌代谢失调是导致这些小鼠发生肝癌的主要原因，不能简单推及人类。

实验中采用的膳食纤维菊粉是经过精炼提纯的，且不清楚提取和加工过程中产生的一系列化学变化，与天然食材对人体的影响是不一样的；况且菊粉来自菊苣根，我们一般不食用。

代谢组学分享，研究中膳食纤维摄入过量，菊粉每天摄入量是法定最高摄入量的14.29倍，严重超量。并且在高摄入量下，野生型小鼠仍然没有产生肝癌，说明适量食用菊粉并不有害健康。再说就是因为人们摄入量少，所以才建议适量补充膳食纤维。

除非经过精深加工，一般天然食物中同时含有水溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维，只是二者的比例有所不同，目前没有报道天然食物会带来疾病风险。

最后百趣代谢组学小趣建议还是不要盲目相信高度精炼的食物补充剂，应该以天然食材为最主要的膳食来源，多吃水果和蔬菜，身体才会棒棒哦。