抽象
具有高空间分辨率和力灵敏度的纳米压痕技术广泛用于测量硬质生物材料和组织的机械性能。然而，其分析软生物材料和器官的可靠性尚未经过测试。在这里，我们评估了纳米压痕测量软生物标本的被动力学性能的效用。从C57BL / 6 N小鼠中收获肾脏，肝脏，脾脏和子宫样品。我们使用Bland-Altman图，类内相关系数（ICC）和受试者内变异系数（COV）评估了生物标本和水凝胶对照中的测试-复测试重复性。结果使用Hertzian，JKR和Oliver & Pherr模型计算得出。与水凝胶类似，所有生物标本的Bland-Altman图在刚度测试和复试检查中表现出良好的可靠性。在所有三种模型中，ICC均大于0.8，COV小于15%。在肾脏，肝脏，脾脏和子宫中，ICC仅在Hertzian模型中始终大于0.8，而在JKR和Oliver & Pherr模型中则不然。同样，仅在赫兹模型中肾脏、肝脏、脾脏和子宫的COV始终小于15%，而在其他模型中则不然。我们得出结论，纳米压痕技术在检测肾脏，肝脏，脾脏和子宫的硬度方面是可行的。赫兹模型是提供所研究生物标本离体器官刚度可靠结果的首选方法。
材料和方法
动物
从5周，10周，20周和30周龄C57BL / 6 N小鼠解剖肾脏，肝脏和脾脏。对于肾脏和脾脏，使用每种性别和年龄的2只小鼠。对于肝脏，使用每种性别和年龄的2至4只小鼠。对于子宫，使用了八只小鼠，所有这些小鼠都在100天左右。这些实验得到了当地动物护理委员会（LAGeSo，德国柏林）和马克斯·德尔布吕克分子医学中心（MDC）动物福利官员的批准（编号X 9011/19）。
基质水凝胶
具有不同刚度的水凝胶（1 kPa，2 kPa，4 kPa，8 kPa，12 kPa和25 kPa）从Softwell，Matrigen，Matrigen Life Technologies，Brea，CA购买，用于质量控制（1 kPa，2 kPa，4 kPa，8 kPa，12 kPa和25 kPa;N = 1 到 3）。
组织制备
左肾和右肾分别从侧中线分为两个（图）。3A），四个部分全部缩进。肝脏样本取自左叶（图）。四A）. 整个收获脾脏用于实验（图）。4选择并打开左子宫角（图）。5答，B）。所有器官都经过清洁，去除器官表面可见的血液，脂肪，膜或血管，但避免损坏它们的实质。为了获得平坦的表面，我们将所有样品粘贴到直径为6厘米的培养皿底部，并用虫胶（Sigma）使外表面平整。将组织样品浸入PBS（NaCl 4.0 M，KCl 137.0 M，Na2高原油40.01 米，千米2采购订单40.0018米;酸碱度 7.4）。
纳米压痕
为了确定弹性特性，我们使用了位移控制的纳米压痕仪（Piuma;光学11，荷兰阿姆斯特丹）。该设备采用套圈顶部悬臂探头32，33施加负载并使用基于光纤的读数同时测量压痕深度（图）。1A）. 我们使用半径为 50 μm 且悬臂刚度为 0.5 N/m 的球形探头。在每一系列实验之前，通过压入刚性表面并将悬臂弯曲等同于探头位移来进行悬臂弯曲校准。之后，将探针聚焦在组织表面的适当区域（图。1B、3A、4A、5A、6B）。在25×5 μm网格扫描中，将每个凝胶压痕5次（800×800个基质），测量间隔距离为200 μm。肾脏、肝脏和脾脏样品在9××3μm网格扫描中用3个压痕（200个基质）压进（图。200B、3B、4B）。在子宫中，分别在子宫的近端、中部和远端测试了 5 × 4 μm 网格中具有 100 个单压痕的三个压痕矩阵（图）。100B，C）。应用的压痕方案由在6 nm压痕深度下4 s的加载阶段（保持8000秒）和卸载阶段4 s组成。所有扫描都进行了两次，以分析可靠性。左右肾四个部分所有结果的平均值表示为肾脏弹性。凝胶、肝脏和脾脏的硬度表示为每次扫描中所有结果的平均值。三次扫描结果的平均值作为子宫硬度。所有单个压痕值均由 Piuma Dataviewer 版本 2.2 （Piuma;光学11，荷兰阿姆斯特丹）。
讨论
Piuma纳米压痕技术已广泛应用于硬动物器官的生物材料刚度研究，例如骨骼25、耳内、鼻翼和鼻外隔细胞和细胞外基质 （ECM） 水平24，26，在膝关节22，在关节软骨中23.其他例子是人类供体角膜27、纤维化肠组织30、胰腺无细胞支架31、软板28尤其是钙化的动脉瘤腹主动脉29.该技术在测量软生物材料，特别是离体器官的刚度方面的可行性和可靠性尚不清楚。与硬质生物材料相比，软质生物材料的某些性能，如粘弹性和附着力，更容易出现纳米压痕的偏差。我们的研究是第一个使用这项技术在体外测试软生物器官的刚度，特别是来自小鼠的刚度，这些器官广泛用于模拟人类和动物疾病。我们应用了Piuma纳米压痕技术，该技术易于使用，并利用特定的探针来测量杨氏模量，以匹配组织的特定样品特性42，43，44 .不同的组织具有不同的机械性能，因此，应在具有某些特殊特征的组织中应用不同的方案45.由于在实验前无法判断被测样品的特征，因此我们分析了加载和卸载零件的弹性行为检测。除了系统的运行和测量策略的开发外，组织的制备和固定也非常重要。不规则的组织无法测试，因为该设备只能识别平坦稳定的表面，并且刚度的计算会受到样品状况的影响。例如，如果被测表面是斜率（补充1，图1A），则接触区域不会被探头尖端完全缩进，这意味着失去深度和力可能导致刚度测量错误。球状器官（补充1图1B）也是不可测试的，因为它在测量过程中不能稳定。此外，由于组织边缘的障碍物，该技术不可能测试下沉的表面（补充1图1C）。块状表面（补充1图1D）不仅会影响测量结果的准确性，还会导致探头悬臂因卡住而损坏。一起，需要以适当的形状和大小制备可测试的被测组织。我们确实克服了纳米压痕技术的可行性和可靠性的这些可能限制，该技术通过使用以适当方式解剖的孤立肾脏，肝脏，脾脏和子宫来测量软器官硬度。我们通过对该技术与Matrigen水凝胶的比较研究证实了结果的可行性和可靠性。在给定刚度，稳定形状，适当厚度和平坦表面的Matrigen水凝胶作为质量控制，尽管它们给定的刚度不被认为是黄金标准。然而，我们的Bland-Altman图、ICC和COV证明了所用凝胶的良好可靠性。因此，我们得出结论，纳米压痕技术在我们的实验室环境和这种材料上运行良好且可靠。
接下来，我们测试了该技术在体外测量四个器官的硬度，即肾脏，肝脏，脾脏和子宫。尽管Bland-Altman图没有给我们提供许多不合格的结果，但不同模型中四种器官硬度的结果的可靠性只能通过比较ICC和COV来验证。在四个器官中，所有赫兹模型的结果都遵循ICC的量化标准，COVs显示出可靠的结果。JKR或Oliver & Pharr模型的结果并不总是符合高质量标准。观察到差异的原因可能取决于样品在卸载状态下的粘性差异。
例如，在JKR模型中，即使在相同的样品上，一些斑点是粘性的，而一些单个压痕显示没有粘附，如图所示。1E，这将增加测试和重新测试之间的差异。因此，我们的结果表明，在强制压痕下，最好使用赫兹模型计算所研究的四个器官的硬度。值得注意的是，该模型已被其他研究人员使用，他们在研究中利用了纳米压痕技术。27，28，29 ，而其他研究没有报告使用的模型30，31.此外，将子宫与其他三个器官的结果进行比较，我们发现即使在赫兹模式下，根据Eff计算硬度的情况下子宫的COV值为11.6893%，在根据E计算刚度的情况下，子宫的COV值为14.1841%，非常接近阈值，远高于赫兹模型中其他三个器官的COV值。这表明重复测量子宫之间的差异大于肝脏，肾脏和脾脏的变异性。一个可能的原因是子宫比其他三个器官更小更薄，在实验过程中，我们发现更小更薄的器官子宫的边缘更容易卷起，导致类似情况如补充1图1B所示，预计会影响测量结果。因此，该方法在体外较大较厚的软器官中的可靠性较好。
此外，纳米压痕的成功应用在很大程度上取决于材料特征，例如被测组织的形状;测量具有复杂粗糙表面的生物材料往往很困难。当一个组织被手工转化为可以测试的材料时，不知道它的弹性是否保持与原始器官的弹性相同的性质，以及器官的部分弹性是否可以代表其整体弹性。因此，对于某些器官研究，体内测试可能是提供器官机械性能详细见解的更好甚至唯一的选择。然而，体内测试在测量过程中可能会受到其他因素的干扰和影响，因此纳米压痕器可以直接与目标材料接触进行测量可能是一个优势。目前，该技术的应用存在较多的局限性和不足。例如，其有效性和真实性仍需进一步验证，生物材料纳米压痕的标准化程序尚未建立。因此，我们不能肯定它是否会成为软器官和组织机械生物学和生物力学研究中不可或缺的工具。然而，随着这项技术的研发越来越深入，我们预计它将有很大的机会应用于软器官生理学和病理学等多个领域的研究。
结论
Piuma纳米压痕技术是一种简单可行的离体器官硬度测试方法，如肾脏，肝脏，脾脏和子宫。在表面无序的小而薄的组织中，我们预计结果的变化会增加。赫兹模型是体外测量软器官和生物材料的被动力学性能的最可靠方法。JKR和Oliver & Pharr模型没有完全提供可靠的结果。
技术参数
| 模量测试范围 | 5 Pa - 1 GPa |
| 探头悬臂刚度 | 0.025 - 200 N/m |
| 探头尺寸(半径) | 3 - 250 μm |
| 最大压痕深度 | 100 μm |
| 传感器最大容量 | 200 |
| 测试环境 | air, liquid (buffer/medium) |
| 粗调行程 | X*Y：12×12 mm Z：12 mm |
加载模式 | Displacement / Load* / Indentation* |
| 测试类型 |
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