在视网膜类器官内建立稳定、长期存在的血管系统十分困难，这主要是由于血管内皮细胞（ECs）和神经细胞（视网膜细胞）的培养方案互不兼容：内皮细胞的管腔结构和活性要求添加高浓度的血管内皮生长因子（VEGF）和专用的内皮培养基（如EGM-2）。然而，这种培养基环境对视网膜神经元的成熟是有害的，长期高浓度的VEGF甚至会导致视网膜组织的病理变化。

因此，该研究明确提出“瞬时血管支持”的概念。试图通过让内皮细胞在早期形成一段时间的血管样网络，帮类器官核心区缓解缺氧与凋亡压力，从而显著提升RGC的长期存活率并促进其功能成熟。

具体而言，他们利用转录因子ETV2.2诱导人诱导多能干细胞（hiPSCs）定向分化为内皮细胞（ECs），并在第7天胚状体成型后，再置于预分化好的内皮细胞单层上，从而成功诱导内皮细胞迁移并整合入类器官内部，形成PECAM1阳性的血管样网络。这些结构在形态上具备管腔特征，但并不等同于成熟血管，其存在时间随类器官发育逐步缩短。

实验观察到，这些内皮细胞在类器官内表现出极高的组织能力。在第4至8周，PECAM1阳性的细胞形成了典型的血管样分支结构，随后在第10周达到约74.22 ± 5.85 μm的平均长度，随后长度与面积逐渐下降，在第22周仍可检测到残留信号。这一动态变化本身提示，该系统并非依赖持续血管灌流维持组织，而是在关键发育窗口内降低缺氧与细胞凋亡压力。活体缺氧成像也证实，血管化类器官（vROs）内部的缺氧程度显著降低。

最后，随着培养进入中后期（约12周后），为了让视网膜的光感受器和双极细胞顺利成熟，研究者必须切换回神经系统专用的成熟培养基。由于缺乏持续的血管营养因子支持，这些已经形成的微血管网会逐渐退化。这种“瞬时血管化”的设计其实是一种精妙的平衡：在类器官发育最快、对氧气最渴求的早期阶段（即内部最容易因缺氧而导致RGCs凋亡的阶段），提供血管支持来“救命”；等RGCs度过了最脆弱的时期并建立起初步结构后，再撤掉血管支持，让神经回路在纯净的神经环境中发育。

图：将内皮细胞（ECs）与视网膜类器官（ROs）进行整合

vROs的直径在各个观察节点均显著大于对照组，并在第12周左右达到峰值。且该差异并非由类器官融合率增加导致。

图：血管化特征的表征，及其对类器官的影响

更重要的是，血管化显著降低了早期凋亡水平，从而推迟了视网膜神经节细胞的消失时间。流式细胞术检测显示，从第12周起，vROs中的Annexin V阳性早期凋亡细胞比例大幅下降。这一差异在第17周和第26周尤为明显，提示血管样结构在延缓发育中后期细胞死亡方面发挥作用。在第18周的统计中，vROs中的POU4F1阳性RGCs比例竟然维持在18.2% ± 4.31%，相较于对照组的1%左右，存活率提升了近二十倍。

图：vRO 中的 RGC 存活率增强

单细胞与单核RNA测序则显示，血管化类器官中额外富集了一类占比约4.2%的血管相关细胞群，对照组仅为0.7%，且该细胞群比例与神经节细胞比例呈显著正相关（Spearman r = 0.89，p = 0.007），指向血管相关微环境与神经节细胞长期存活之间的直接关联。

仅仅依靠血管化解决营养供应并不足以构成有效模型。研究者推测，RGCs在类器官中的退化可能也与其轴突无法定向生长、缺乏靶标连接有关。

为此，他们设计了一个巧妙的集成平台：将血管化类器官置入带有微流控装置的多电极阵列（MEA）芯片中。该装置通过PDMS微通道引导RGC轴突从类器官中向外延伸，模拟了体内视神经纤维层的定向排列，为轴突提供了机械张力和结构支撑。此外还通过与微电极直接接触，实现了无损、长期的电生理记录。

结果发现，在微流控的“导航”和血管化的“补给”双重加持下，RGCs不仅活了下来，还实现了功能上的飞跃。单细胞测序预测显示，vROs中处于“命运确定”状态的成熟RGC比例达到52%，远高于对照组的36%。电生理记录证实，这些RGCs不仅表现出稳定的自发放电，更在第20周后表现出持久的神经网络活动，而此时的对照组类器官通常已经失去了功能信号。

图：RO中自发和光遗传诱发的 RGC 活动

这项研究最令人振奋的成果在于，这些培养超过30周的血管化类器官展现出了由光感受器驱动的复杂回路电活动。通过光刺激，研究人员在RGC水平上检测到了经典的ON、OFF以及ON-OFF型反应。其中，ON-OFF神经元在470 nm和580 nm光脉冲下表现出最强的响应，峰值频率分别超过237 Hz和281 Hz。三类神经元的反应延迟分别集中在20–36 ms、130–187 ms以及中间区间，构成典型的功能分化谱系。

这种具有时序差异和功能分化的信号传递，证明了类器官内部已经建立了从光感受器到双极细胞再到RGCs的垂直功能回路。这是目前体外视网膜模型所能达到的最高功能化水平之一。且ON与ON-OFF型神经元在超过90%的光脉冲中产生稳定响应，而OFF型神经元的响应比例分别为72%和53%，高度符合体内视网膜生理特征。

图：PR驱动的光响应

除了优化模型，研究团队还展示了血管化类器官在模拟人类疾病方面的巨大潜力。他们通过降低氧浓度（4% O2）并添加血管内皮生长因子（VEGF），在类器官中成功模拟了早产儿视网膜病变（ROP）的核心病理特征：病理性新生血管生成。

在诱导缺氧的条件下，vROs展现出显著的血管重塑，PECAM1和vWF等血管标记物的mRNA表达量大幅上调。这种模型为研究缺氧如何驱动异常血管增生，以及筛选针对ROP或其他增殖性视网膜病变的药物提供了极其宝贵的类人平台。

图：缺氧诱导的vROs心血管形成模拟了ROP病理特征

总的来说，这项研究通过“瞬时血管化”与“轴突引导”的生物工程组合拳，不仅延长了类器官中RGCs的保鲜期，更将其功能成熟推向了新的高度。它告诉我们，类器官研究正在从单纯的细胞自组织向复杂的系统集成演进。未来，通过进一步完善流体动力学模拟和神经靶标整合，这种“血管化”的类器官有望成为精准医学和再生医学中不可或缺的实验基石。