酵母裂解酶-100T来自藤黄节杆菌
Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus
-----MP Biomedicals New Zealand Limited
Zymolyase-20T(酵母裂解酶-20T)是通过Arthrobacter luteus(藤黄节杆菌)深层培养获得的酶制剂,它能有效的裂解活酵母细胞细胞壁。该制剂是利用亲和层析法部分纯化获得的冻干酶,其酶活单位是100,000 单位/g.其中主要负责裂解活酵母细胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶,通过对ß-1,3-葡聚糖连接位水解葡萄糖聚合物,释放产物主要是昆布五糖。
产品说明:
单位定义:800nm条件下菌液吸光度下降30%,表示一个活力单位。
特异性:此产品的裂解谱包括以下属的生物:Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.
说明:酵母细胞的裂解程度随酵母菌的种类、生长阶段及培养条件而改变。
声明: Zymolyase是麒麟麦酒股份有限公司(Kirin Brewery Co., Ltd)的注册商标。
储存:冻干状态于2-8°C中保存,若30°C下放置3个月约失去90%活力。
外观:冻干粉
活力:100,000单位/g
其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶,约1.0 x 107 单位 /g
蛋白酶,约1.7 x 104单位 /g
甘露聚糖酶, 约6.0 x 104单位 /g
淀粉酶,木聚糖酶,***酶,微量DNase及Rnase(未检出)
催化剂:二硫苏糖醇(DTT), ß-巯基乙醇及其他的巯基化合物(如半胱氨酸)
最适pH及温度:
pH 7.5, 35°C裂解活酵母细胞
pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖
热稳定性:60°C,5min丧失细胞溶解能力
警告:(1)ZymolaseØ-100T溶解度低,以悬浮液的状态使用。如果需制备浓度超过0.05%的无菌酶溶液,则通过将ZymolaseØ-100T溶解在含5%葡萄糖的缓冲液中(pH 7.5),首先配制2%的酶储存液;(2)吸取悬浮液,留下沉至容器管底的任何物质;(3)不推荐使用**纤维过滤器;(4)稀释无菌的酶悬浮液至目标浓度。
原生质球制备程序:
1. 室温条件,5000rpm(3000 xg),5min离心酵母培养物;
2. 收集离心沉淀物(酵母细胞)并记录湿重;
3. 用TE缓冲液悬浮细胞,加入量为1.4ml/g湿重细胞;(TE缓冲液配方:100 mM Tris [MP 8196231],pH 8.0,100 mM EDTA [MP195173])
4. 双蒸水快速定容,终体积量为3.5ml/g湿重细胞;
5. 按照17.5 ul (总体积的1/200)/ g湿重细胞的量加入ß -巯基乙醇(MP 806445),目的是为了除去细胞外层中的甘露聚糖层;
6. 30°C轻摇温育混合液,处于对数期生长的培养物处理15min,处于稳定期生长的培养物处理45min;
7. 室温条件,5000rpm离心5min;
8. 用S缓冲液重新悬浮细胞,加入量为4.0ml/g湿重细胞;(S缓冲液配方:1.0 M 山梨糖[MP 102938],10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5)
10. 再次用S缓冲液(4.0ml/g湿重细胞)悬浮细胞,另外加入Zymolyases(50U /g湿重细胞);如果Zymolyases配制成附录所示的溶液,则添加250ul即可。最好根据实验情况最先优化酶使用量。
11. 30°C轻摇温育混合液30min,根据以下方式监测原生质球形成程度:
(1) 加1ul样品到20ul S 缓冲液内,原生质球应该保持完整;
(2) 加1ul样品到20ul双蒸水中,原生质球应该破裂;显微镜下观察比较两个样品的形态差异。
12.一般情况下反应45-60min,原生质球的形成量>90%,此时4oC下离心收集细胞,5000rpm,5min;
13. 再次用S缓冲液(2 ml/g湿重细胞)悬浮原生质球,5000rpm离心5min;重复此步骤做第二次清洗;;
14.原生质球离心沉淀物-70oC冻存。
温和的裂解原生质球方法如下; 用3倍体积的18%Ficoll(MP 160003)溶液悬浮细胞离心沉淀物,Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 (MP 195088)的10 mM PIPES 缓冲液内,pH 6.5。
酵母菌基因组DNA的制备:
以下步骤快捷,适合于从少量酵母培养物中制备基因组DNA :
1. 将过夜培养的10ml酵母菌培养物离心收集细胞,加入280ul TE Buffer(配方见原生质球制备程序中的步骤3),300 ul双蒸水,3 ul ß -巯基乙醇(MP 806445);
2. 30oC温育45min;
3. 以台式离心机的最高速度离心2-3s,弃上清液,沉淀物用500 ul S 缓冲液(配方见原生质球制备程序中的步骤8)悬浮.;再次离心弃上清;
4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T(MP 32-092-1)的S缓冲液悬浮细胞沉淀物(或者使用自己认为最合适的酶浓度);
6. 重复步骤3;
7. 用200 ul含有0.1%SDS(MP 190522)和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 缓冲液悬浮细胞沉淀物;
8. 37oC温育3小时,不时的混匀溶液;
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