组蛋白 β-羟基丁酰化（β-hydroxybutyrylation, Kbhb）是一种新型赖氨酸翻译后修饰，与代谢状态密切相关，已被证实参与调控染色质结构与基因表达。组蛋白 β-羟基丁酰化修饰的丰度极低，且常与乙酰化、甲基化等其他修饰共存，极易被掩盖。高效、专一的样品前处理流程，是实现高灵敏度质谱检测、精准修饰位点定位的前提。

一、 组蛋白 β-羟基丁酰化分析的标准样品前处理流程

1、细胞/组织裂解与组蛋白提取

获取高质量组蛋白的第一步是构建一个保护性裂解环境，尤其是针对组蛋白这种富含翻译后修饰的蛋白质，裂解条件需尽量温和，同时具备抑制去修饰酶活性的能力。细胞样本如HEK293T、HeLa等常规贴壁系，建议在冷PBS中洗涤后，加入高浓度酸性缓冲液（如0.4 M HCl）直接裂解核结构。在裂解液中添加蛋白酶抑制剂和去乙酰化酶/去酰化酶抑制剂（如TSA、nicotinamide）是保留组蛋白 β-羟基丁酰化修饰的关键步骤。组织样本可先使用组织研磨仪或匀浆器破碎，再采用酸性缓冲液提取。整个流程应始终保持低温（4°C），并在旋转条件下充分提取1小时以获得尽可能多的组蛋白。随后，通过三氯乙酸（TCA）沉淀方式将蛋白质集中，再使用预冷丙酮清洗杂质与酸，最终获得干净的组蛋白沉淀。

2、组蛋白分离与纯化

在分析如H3K9bhb、H4K12bhb等具体位点前，常需对组蛋白亚型进行分离纯化。此步骤不仅提高分析分辨率，也有助于聚焦研究重点。实验上常用两种方法进行分离：一是SDS-PAGE，适用于小量样品及特定组蛋白带的切胶分析；二是反相高效液相色谱（RP-HPLC），适合大规模纯化特定组蛋白，尤其是H3和H4。建议根据实验目标选择合适方式。若重点研究H3上的羟基丁酰化位点，可先利用HPLC收集高纯度H3组分，再进入下一步酶解流程。

3、酶解

组蛋白结构的独特性，使其在酶解中极易产生极短肽段，降低了质谱检测的灵敏度与覆盖率。胰蛋白酶虽为常规酶种，但单独使用往往不理想。更有效的策略是使用组合酶解，例如胰蛋白酶联合Lys-C，可在不牺牲识别位点数量的前提下获得更适合质谱检测的中等长度肽段；Glu-C亦是常用替代选择，特别适合目标修饰位于谷氨酸残基附近时使用。建议控制酶解时间在4至16小时之间，采用两阶段酶解策略（先短时预酶解，后长时充分酶解）可获得更稳定的结果。此外，酶解时的缓冲液条件（如pH、离子强度）也应根据酶种进行优化，避免失活。

4、β-羟基丁酰化修饰肽段富集

在未富集的肽段混合物中，β-羟基丁酰化肽仅占极小比例，几乎无法直接在质谱中识别。目前最常用的是免疫亲和富集法。该方法依赖高亲和力的 pan-Kbhb 抗体，通过磁珠固定化操作选择性结合修饰肽段。实验中，将酶解后的肽段溶液与预活化抗体磁珠在4°C条件下旋转孵育8-12小时，有助于达到饱和结合。洗脱过程同样关键，建议使用含0.1%三氟乙酸（TFA）或0.2%甲酸（FA）的溶液，温和释放结合的修饰肽段，避免破坏结构或修饰。需要注意的是，抗体质量直接决定富集效率与特异性。

5、脱盐纯化与质谱上样

富集后的肽段需经过C18固相萃取小柱进行脱盐处理，以去除缓冲盐离子和干扰物质，确保进入质谱系统后不会造成离子抑制或电喷雾效率下降。推荐流程包括以下步骤：先用高浓度有机溶剂（如50%乙腈）活化小柱，再用0.1%甲酸平衡；样品加载后，使用低强度洗液清除杂质；最后用80%乙腈+0.1%甲酸溶液洗脱目标肽段。洗脱液应经SpeedVac浓缩至干，再重悬于0.1%甲酸缓冲液中，即可用于LC-MS/MS分析。为了确保数据的一致性与可比较性，建议在每批样品中加入内标肽段进行质量监控，尤其在开展多条件比较实验（如处理组 vs.对照组）时尤为必要。

虽然组蛋白 β-羟基丁酰化的研究仍属新兴领域，但通过上述高标准的样品前处理流程，科研人员可获得更稳定、更高质量的质谱原始数据。在实际项目中，百泰派克生物科技也积累了针对Kbhb修饰的标准化操作方案与抗体筛选经验，助力科研客户从样本到数据再到机制解析，全流程无忧。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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