小鼠初级运动皮层（Mouse primary motor cortex，MOp）是额叶的一部分，主要负责计划、控制、运动执行，尤其是任何延迟反应有关的动作。在垂直方向上，皮层可以分为L1-L6六层，每层的形态和功能都有区别。大脑皮层的谷氨酸能神经元按其投射特性分为脑内(IT)神经元、大脑下投射神经元(或锥体束神经元)和皮质丘脑投射(CT)神经元；γ-氨基丁酸(Gaba)能神经元可以根据发育起源于内侧神经节隆起和尾神经节隆起进行分类，并可以通过小白蛋白(Pvalb)、生长抑素(Sst)、血管活性肠肽(Vip)和Lamp5等标记基因进一步分类。单细胞转录组学研究揭示了大脑细胞的高度多样性，并报道了在单个皮层区域中存在数十到上百种细胞类型。然而，想要了解不同类型细胞对大脑功能的作用仍然缺乏一个高分辨率、包含细胞空间组织和连接信息的细胞图谱。庄小威团队使用MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，多路抗错荧光原位杂交）来识别不同的细胞类型，并绘制它们在小鼠初级运动皮层(MOp)中的空间图谱。通过整合MERFISH和神经逆行标记，进一步揭示了不同类型细胞的投射模式的复杂性。

1.1 MERFISH成像及细胞聚类分析

作者选择了258个标记基因进行MERFISH成像，其中包括已知的大脑皮层中主要神经元和非神经元细胞类型的典型标记基因，以及由单细胞和单核RNA测序联合鉴定的神经元簇中差异基因表达以及互作分析选定的标记基因。MERFISH成像后将mRNA分配到单个细胞中，258个基因中有4个染色“不合格”，在随后的分析中排除。从MERFISH中得到的单个细胞平均基因拷贝数在其他小鼠中可以重复，并且与混合RNA-seq测定的基因表达水平具有高度的相关性(图1)。之后，通过无监督的聚类分析的MERFISH衍生的单细胞表达谱鉴定了39个兴奋性神经元簇，42个抑制性神经元簇和14个非神经元簇(图2)。

a,单个视场的解码MERFISH图像，白线为识别的细胞。比例尺，20 μm（左）和 5 μm（右）。b，DAPI（左）和poly（A）RNA（右）图像。

图2基于MERFISH的细胞类型分析，基于共同坐标框架的MERFISH图像配准和细胞组成

a，树状图显示了MERFISH鉴定的39个谷氨酸能簇、42个gaba能簇和14个非神经元簇之间的层次关系。b，用UMAP细胞类型进行分类。c&d，MERFISH 确定的细胞亚类与scRNA-seq 和snRNA-seq数据集确定的细胞亚类之间的对应关系。e，MERFISH对不同细胞簇染色示意。f，整个成像区域以及初级运动皮质(MOp)中三个主要细胞类别。

1.2细胞分布的空间差异

MERFISH 图像直观地显示了在 MOp 及其邻近区域细胞的转录差异(图3 a)。谷氨酸能细胞簇，特别是IT亚类，在全部分层都有分布(图3b)。与几乎跨越整个皮层的IT细胞不同，ET、NP、CT和L6b细胞只分布在较深的分层(图3 b，c)。个别的谷氨酸能细胞簇沿着皮层方向呈现出区分明显的、部分重叠的分布，而且这些细胞簇许多呈现分布宽度小于个别皮层的厚度。Gaba能神经元也表现出高水平的空间多样性，Lamp5、Sncg和Vip亚类在表层更多，而Sst和Pvalb亚类在深层更多(图3b，d) 。值得注意的是，在亚群水平，大多数Gaba能亚群优先分布在一个或两个皮质层(图3d)。作者还绘制了非神经元细胞的空间组织(图3b，e)。在三个星形胶质细胞群中，星形胶质细胞1分布于各层，星形胶质细胞2分布于L1和白质中，星形胶质细胞3几乎只分布于白质中。少突胶质细胞谱系分为少突胶质前体细胞和3个成熟少突胶质细胞群，成熟少突胶质细胞在白质中富集，少突胶质前体细胞均匀分布于各层。血管软脑膜细胞形成皮层的最外层细胞。其他类型的非神经细胞在皮质层和白质中的分布更为分散。

作者注意到不同细胞种群在空间上大量混合。为了量化每个细胞邻近区域的细胞组成的复杂性，确定了每个细胞邻近区域存在的不同细胞簇的数量，并观察到高水平的局部细胞异质性，细胞邻近区域的组成复杂性向深层递增(图3f)。

a，冠状切片中细胞群的空间图。基于Allen图谱确定的MOp区域是灰色的。b，相同切片的谷氨酸能(左)、