酵母杂交通关攻略
Q:利用去除激活域的转录因子X作为诱饵，筛选到互作蛋白Y。再利用X的全长蛋白导入AD载体，Y导入BD载体，共转AH109的结果显示不互作。怎么解析？
A:这个问题可以从两个方面分析：1.确保第一次共转化验证是否是阳性，用Y2H菌株替换AH109试试，AH109菌株相对更容易产生假阳性；2.确保初次验证是阳性结果，第二次验证是阴性结果，猜测可能是融合的相应的BD和AD的结构域蛋白包裹了诱饵或者猎物蛋白结构域，因为酵母表达系统是真核系统，表达的蛋白是具有结构的非线性的构象，如果蛋白分子量不大，可以采用诱饵和猎物蛋白两次串联方式的构建，或者某个重要结构域重复串联。
Q:如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理？
A:为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3’AT超过15mM，ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。
Q:酵母单杂诱饵启动子我该选择全长还是核心区域？
A:全长：优点：更接近于自然条件下的启动环境；缺点：有时候过于长，导致构建具有一定的难度，更可能的产生自激活现象；
预测的核心元件（<20bp）：优点：核心元件用于后续的EMSA验证试验，对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱，相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便；缺点：核心元件虽然是启动的核心区域，但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的，如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境，可能产生假阴性；
Q:膜系统功能验证是怎么做？
A:NMY51(PBT3-N-bait+post1-NubaI)此为功能验证组，NubaI为野生型的ubiquitin的N端结构，保留了原始的三个I氨基酸结构，可以在不需要两个蛋白产生相互作用的情况下两个C端和N端的ubiquitin结构域结合在一起产生具有功能的ubiquitin，从而激活下游的报告基因。结论：在二缺平板上正常生长，说明共转化成功，并在缺陷TDO+X-a-Gal的平板上显蓝色说明我们的bait构建的读码框正确（也就是我们构建的诱饵扩谱结构可以满足筛选的需要）。并且我们的ubiquitin系统是存在功能的。
Q:膜蛋白酵母双杂交过程需要注意的问题与细节？
A:膜蛋白的筛选是采用共转化的方式进行的，筛选的假阳性率相对核蛋白的mating方式筛选假阳性率要低一些，但是共转化筛选对转化效率有要求，不然会产生假阴性。如果采用化学转化对感受态转化效率有一定的要求，至少达到10的4次方，感受态细胞的溶氧的提到（装液量不超过1/5）对感受态的效率提高有帮助。电转化感受态保存10%的甘油，转化参数800v,15m转化效率可以到10的5次方到6次方。
Q:请给个预测靶蛋白的网站，植物。
A:http://domine.utdallas.edu/cgi-bin/Domine
https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=ksdvF3MraTE8&input_page_active_form=single_sequence
Q:相对其他公司而言，金开瑞在酵母杂交业务上具有什么样的优势？
A:从文库构建来说：
文库构建方式灵活：根据样本的类型，提供的样本量等方面考虑，可采用smart，geteway，infusion体外重组和T4体外连接等方式进行文库构建；
文库片段大小可控：根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小，以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素，生长因子类的小分子蛋白；转录因子，信号通路类的分子量稍大一些的蛋白；
单双杂文库通用：构建一种类型的文库，可同时用于单双杂筛选；
对于文库筛选来说：
筛库方式多样：可采用matting或共转的方式进行文库筛选；
互作强弱可控化：提高（降低）筛选压力，用于筛选出强（弱）相互作用的蛋白。
阳性结果进一步验证：文库筛选出的阳性结果，可进行点对点验证进一步排除假阳性。
Q:酵母杂交年末有活动吗？
A:有，建库、筛库、点对点都有活动，赶紧联系您的对接销售了解详情吧。
