疾病研究利器 —— 外显子组测序
外显子组测序基本概念
外显子：真核生物基因的一部分，能够在RNA 剪切后保留下来并作为成熟RNA 产物的一部分。
外显子组：一个物种基因组中全部外显子区域的总和。
外显子组测序：对一个物种基因组中全部外显子区域进行测序的技术。主要包括两步：获取基因组中全部外显子区域；采用高通量的测序技术对这些区域进行测序。
外显子组测序基本流程
外显子组测序的基本流程如图，即利用物理或化学手段对基因组 DNA 进行片段化，采用杂交或 PCR 扩增的方法富集外显子，采用高通量测序平台对获得的序列进行测序，并进行生物信息分析，获得变异信息。
外显子捕获平台
在整个外显子组测序流程中，外显子捕获是关键环节，现有的捕获手段按照捕获原理可以分为两大类：即杂交法和多重 PCR 扩增法。按照杂交的环境分为固相和液相杂交，按照PCR扩增方式分为多重PCR和分子倒置探针。基于这些方法开发出的相应平台和技术参数见下表。
基于多重 PCR 的目标区域富集方法，在捕获目标区域时，需要进行 PCR 扩增，因此对样品的起始量要求低；同时由于不同区域 PCR 的扩增效率不同，容易出现扩增偏爱性，导致不同目标区域覆盖均一性差，并且在 PCR 扩增过程中容易引入碱基错误。该方法主要适用于目标区域捕获片段较小且样品起始量比较低的情况。
基于杂交的目标区域富集方法，对目标区域的覆盖均匀，不引入错误；其缺点是对样品的起始量要求高。该方法主要适用于全外显子组捕获测序或者较大目标区域的捕获测序。目前，主流的全外显子捕获平台主要包括 NimbleGen公司开发的 SeqCap EZ Exome Enrichment Kit v3.0 捕获平台以及 Agilent 公司开发的 SureSelect Human All Exon V6 捕获平台。
实验策略
a) 测序平台： Illumina Hiseq
b) 测序数据量：6-12G/个体
c) 覆盖倍数：100-200×
d) 捕获试剂盒：SeqCap EZ Exome Enrichment Kit v3.0或SureSelect Human All Exon V6
全基因组外显子测序已在孟德尔疾病或罕见综合征的研究中取得了重大突破, 证实了全基因组外显子测序对鉴定孟德尔疾病或罕见综合征的致病基因是行之有效的；可以运用在复杂疾病的研究中,目前在肿瘤方面的研究较多,但由于该技术存在一些尚待完善的问题,导致全基因组外显子测序在常见疾病的研究进展缓慢,但随着技术的发展和后续分析手段的丰富,预期在不久的将来,外显子测序会广泛地运用到其他复杂疾病的研究中;也可以用于疾病的分子诊断,为临床一些难以诊断的疾病提供了一种新诊断思路。因此推荐用于外显子测序的情况：
罕见的家系突变（罕见病）；
常见病中稀有的家系突变；
体细胞变异（癌症）；
致病基因的发现；
临床或者分子检测。
文章发表
近几年，外显子组测序技术的相关研究成果的文章发表数量呈现逐年上升的趋势，见图。文章发表的杂志包括Nature Genetics (IF 29.352), Gastroenterology (IF 16.716), The American Journal of Human Genetics (IF 10.931), Oncotarget (IF 6.359)等。
参考文献
1. Dulak A M, Stojanov P, Peng S, et al. Exome and whole genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity[J]. Nature Genetics, 2013, 45(5):478-86.
2. Robles A I, Traverso G, Zhang M, et al. Whole-exome Sequencing analyses of Inflammatory Bowel Disease-associated Colorectal Cancers[J]. Gastroenterology, 2016, 150(4):931-943.
3. Lixing Yang, Mi-Sook Lee, Hengyu Lu, et al. Analyzing Somatic Genome Rearrangements in Human Cancers by Using Whole-Exome Sequencing[J]. The American Journal of Human Genetics, 2016, 98(5):843-856.
4. Kalaora S, Barnea E, Merhavishoham E, et al. Use of HLA peptidomics and whole exome sequencing to identify human immunogenic neo-antigens.[J]. Oncotarget, 2016.