疾病机理
帕金森病（Parkinson’s disease, PD)又名震颤麻痹，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病。主要病变在黑质和纹状体。震颤、肌强直及运动减少是本病的主要临床特征。帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病。PD疾病形成的主要标志是多巴胺能神经细胞（DAG细胞）的损伤和路易小体的形成。
造模方法
1）外周或脑内注射MPTP
MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶，1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine）本身不带有神经毒性但有很强的的亲脂性，进入脑后先被脑内细胞线粒体外膜的MAO-B（单胺氧化酶B）催化变成中间产物MPDP+，再很快产生自发氧化迅速变成有神经毒性的MPP+。通过外周或脑内注射MPTP可以达到中脑内DAG神经细胞大量凋亡的效果，模拟了人PD疾病。根据每次注射剂量，间隔时间，方式及时间长短的不同，可以制成用于不同研究目的的各种大小鼠模型。
1.急性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每次间隔1~2h，连续4次。建模速度快，损伤严重。不符合人类PD患者的慢性发病机制，其损伤是大部分神经元快速损伤坏死而非慢性的凋亡，模型死亡率高。
2.亚急性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每天1次，连续5~10天。成活率较高，损伤没有急性严重，DAG神经元部分凋亡，但是和人类发病机制仍有差异。MPTP模型对动物损伤是可逆的，可短期产生神经毒性，不是长期神经退行性变化。
3.慢性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每周两次或3.5天一次，连续10次。死亡率非常低，模型稳定，过程稳定不易恢复，DAG神经元凋亡表现缓慢且为渐进过程，与人类PD病程相似。
2）纹状体-黑质系统中注射6-OHDA
6-OHDA（6-羟基多巴胺）是儿茶酚胺的羟基化衍生物，其结构与儿茶酚胺类似，是特异性的神经毒素，不能通过血脑屏障，脑注射6-OHDA可以造成中枢神经系统损伤。注射位置为纹状体-黑质系统。损伤机制为抑制线粒体呼吸链的功能，6-OHDA能直接抑制线粒体呼吸酶复合体Ⅰ（NADH脱氢酶）和复合体Ⅳ（细胞色素氧化酶）活性，从而抑制线粒体酶呼吸链的功能，导致细胞内ATP耗尽，引起细胞死亡。
1.“完全”损伤模型：大鼠脑立体定位注射，位置MFB（内侧前脑束）。
2.“部分”损伤模型：大鼠脑立体定位注射，位置MFB。
3.部分纹状体损伤模型：大鼠脑立体定位注射，位置纹状体。
6-OHDA模型制作过程灵活，可以根据客户需求选择损伤程度、注射位置（纹状体，MFB或黑质）及注射剂量。6-OHDA注射后15分钟即可检测到DA（多巴胺）含量的下降，3~5天内注射位置绝大多数神经元死亡，损伤严重。
实例：
动物：雄性SD大鼠；雄性5-8周龄C57/BL6小鼠
6-OHDA建立啮齿动物半帕金森模型
地昔帕明腹腔注射到啮齿动物体内，30min后，根据立体定向坐标（小鼠左纹状体，AP，ML，DV；大鼠MFB，AP，ML，DV）将6-OHDA[小鼠取2μl；大鼠取3μl，溶解于0.2%（w/v）抗坏血酸（AA）]注入左纹状体或MFB一侧，微量注射泵控制微量注射器（5μl）速率为0.1μl/min。注射后，将注射器留在原位5 min以避免回流。注射6-OHDA后两周（小鼠）或三周（大鼠），进行阿扑吗啡（APO，0.5 mg/kg）诱导的旋转试验，以评估建立半帕金森啮齿动物模型是否成功。注射阿扑吗啡3分钟后人工记录旋转次数，在后续研究中选择10分钟内旋转次数超过40次的啮齿动物。在所有实验之后，用酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色法评估SNc中多巴胺能神经元的丢失。
图1. 小鼠PD造模后行为评估
平衡木实验中小鼠通过平衡木的时间明显延长；APO诱导的旋转实验中小鼠每分钟旋转次数大于4，表明6-OHDA建立小鼠半帕金森模型成功。
MPTP建立小鼠半帕金森模型
用注射泵控制的微量注射器（5μl）以0.1μl min-1的速率将2μl MPTP（溶于生理盐水）注射到左纹状体（AP，ML，DV）。注射后，将注射器留在原位5 min以避免回流。旋转次数计算为注射APO后10分钟内的同侧旋转－对侧旋转。
参考文献：
Zhang H, Zhang C, Qu Z, et al. STN-ANT plasticity is crucial for the motor control in Parkinson's disease model. Signal Transduct Target Ther. 2021 Jun 9;6(1):215.（客户文章）
3）通过病毒载体在黑质过表达α-Synuclein造PD模型（我司开发）
α-突触核蛋白（a-Synuclein）是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，它与帕金森病的发病机制和功能障碍密切相关，是路易小体的主要组成部分。应用脑立体定位技术向大鼠中脑黑质区分别注入携带α-synuclein野生型（WT）与突变型（A30P，A53T）序列的rAAV9X型病毒，并在相应部位实现基因过表达，从而建立PD大鼠模型，并从行为学（ethology）及组织病理、生化角度对该模型进行评价。
雌性8周龄wistar大鼠64只，体重200~250g；根据注射的不同种病毒分为A/B/C/D共4组，每组16只。每组按照递增的注射剂量分为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ四组，每种剂量注射4只。注射后2周，4周时各处死2只进行切片免疫组化成像。结果表明，Ⅳ组表达效果更好。注射后第4，7，10，12周进行走步实验和上肢放置实验等行为学检测，结果表明模型构建成功。
Fig.1A.注射GT-0069 SYN-EGFP病毒2w、4w后的免疫组化成像；B.注射GT-0070 SYN-SNCA(WT)病毒2w、4w后的免疫组化成像；C.注射GT-0071 SYN-SNCA(A30P)病毒2w、4w后的免疫组化成像；D.注射GT-0072 SYN-SNCA(A53T)病毒2w、4w后的免疫组化成像。
随后再进行行为学检测实验。对四组大鼠右侧黑质注射同一剂量4种病毒，注射后第4，7，10，12周进行走步实验和上肢放置实验等行为学检测，结果表明模型构建成功（Fig.2）。
Fig.2A.大鼠走步实验数据统计。其中70组为注射SNCA野生型(WT)，71组为突变型A30P，72组为突变型A53T，69组为EGFP对照组。分别对应注射的病毒编号为GT-0069，GT-0070，GT-0071和GT-0072。B.大鼠上肢放置实验数据统计。
我司优势
◆靶向特异脑区。
◆可以在成年动物中进行转基因表达（避免发育阶段中代偿机制的影响）。
◆可以制备不同剂量，不同物种（啮齿动物，非人灵长类动物均可）和不同基因组合的疾病模型。
◆有时间依赖性的神经病理改变（神经炎症放大和细胞质内含物）。
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